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ESTANDARIZACIÓN DEL CULTIVO DE LINFOCITOS PARA ANÁLISIS
CITOGENÉTICO DE CARIOTIPO HUMANO EN UN LABORATORIO
PRIVADO DE ENCARNACIÓN
Karina Magdalena Cáceres Fernández
1
Laboratorio Bioquímico de Alta Complejidad RH Positivo - Paraguay
Gastón Andrés Sioli
2
Instituto de Genética Humana de Misiones - Argentina
Armando Antonio Gamarra Borja
3
Laboratorio Bioquímico de Alta Complejidad RH Positivo - Paraguay
Recepción: 24/07/2023
Aprobación: 14/11/2023
Resumen
El cariotipo es el análisis cromosómico de un individuo. El estudio de cariotipos a partir
de cultivos de linfocitos es crucial en genética clínica e investigación y se utiliza en el
diagnóstico y seguimiento de enfermedades genéticas asociados a alteraciones
cromosómicas numéricas o estructurales. Es preparado a partir de células vivas, para eso,
es necesario realizar cultivo celular a partir de muestras de sangre periférica, médula ósea
o líquido amniótico, siendo el método más común el cultivo de linfocitos a partir de
sangre periférica. Actualmente, en el departamento de Itapúa, según registros de la base
de datos del Centro de Información Científica del CONACYT (CICCO), no se cuenta con
laboratorios que hayan implementado la técnica, por lo cual el objetivo fue estandarizar
la técnica de cultivos de linfocitos a partir de sangre periférica, para el análisis
citogenético de cariotipos humanos en un laboratorio privado de la Ciudad de
1
Esp. en Docencia Universitaria con Énfasis en Salud. Lic. Genética. Laboratorio Privado de Análisis
Clínicos RH Positivo. karinamagdalenacaceres@gmail.com
2
Lic. en Genética. Instituto de Genética Humana de Misiones, Fundación Parque de la Salud.
gastonsioli@gmail.com
3
Bioquímico. Laboratorio Privado de Análisis Clínicos RH Positivo. armagama@gmail.com
2
Encarnación. Se realizó un estudio de tipo experimental, de corte transversal y con
finalidad aplicada, en el área de Biología Molecular y Citogenética del Laboratorio
privado RH Positivo, en Encarnación, Itapúa. El material biológico fue recolectado de 10
personas de forma voluntaria. Las muestras se sometieron por duplicado a dos ensayos;
el primero, siguiendo las instrucciones del fabricante y el segundo, con modificaciones.
Para el cultivo de linfocitos de sangre periférica se utilizó el medio para cariotipo PB-
MAX™. La observación se realizó bajo un microscopio óptico, a 1000X con aceite de
inmersión para comparar los resultados de ambos ensayos. En el primer ensayo se
obtuvieron pocas células en metafase que se observaban muy cerradas al microscopio
óptico, con presencia de un halo de citoplasma que impedía la fácil identificación de los
cromosomas. Los cromosomas estaban muy cortos, lo que dificultaba la identificación de
las bandas. Sin embargo, en el segundo ensayo se obtuvieron muchas células en metafase,
bien abiertas, sin halo de citoplasma, lo que facilitaba la distinción una de otras. Se
observaron cromosomas de longitud variada y de fácil identificación de bandas. Para la
estandarización del cultivo (segundo ensayo), se obtuvieron metafases de calidad
satisfactoria que presentaron cromosomas de buena longitud, bien extendidos y con
bandeo nítido, lo que hizo posible observar y analizar el cariotipo de los voluntarios,
identificando y agrupando a los cromosomas de acuerdo a su forma, tamaño, posición del
centrómero y patrón de bandas. En conclusión, la técnica permite ofrecer la realización
del análisis de cariotipo a la población de Itapúa y alrededores que presenten antecedentes
de enfermedades genéticas y parejas con problemas de fertilidad, proporcionando
información crucial para el asesoramiento genético y ayuda para la toma decisiones sobre
las opciones de tratamiento.
Palabras claves: Citogenética – Cariotipo – Linfocitos - Sangre periférica.
Abstract
Karyotyping is the chromosomal analysis of an individual. The study of karyotypes from
lymphocyte cultures is crucial in clinical genetics and research, and is used in the
diagnosis and monitoring of genetic diseases associated with numerical or structural
chromosomal abnormalities. Karyotypes are prepared from live cells, which requires
performing cell culture from peripheral blood, bone marrow, or amniotic fluid samples,
3
with the most common method being the culture of lymphocytes from peripheral blood.
Currently, in the department of Itapúa, according to records from the CONACYT
Scientific Information Center (CICCO) database, there are no laboratories that have
implemented the technique, therefore the objective was to standardize the peripheral
blood lymphocyte culture technique for the cytogenetic analysis of human karyotypes in
a private laboratory in the city of Encarnación. An experimental, cross-sectional, and
applied study was conducted in the Molecular Biology and Cytogenetics area of the
private laboratory RH Positivo, in Encarnación, Itapúa. Biological material was
voluntarily collected from 10 individuals. The samples were subjected, in duplicate, to
two assays; the first, following the manufacturer's instructions, and the second, with
modifications. The PB-MAX™ karyotyping medium was used for peripheral blood
lymphocyte culture. Observation was performed under an optical microscope, at 1000X
with immersion oil, to compare the results of both assays. In the first assay, few
metaphase cells were obtained; they appeared very condensed under the optical
microscope, with a cytoplasm halo that prevented easy identification of the chromosomes.
The chromosomes were very short, which made band identification difficult. However,
in the second assay, many metaphase cells were obtained; they were well-spread, without
a cytoplasm halo, which facilitated their distinction from one another. Chromosomes of
varied length and easy band identification were observed. For the culture standardization
(second assay), satisfactory quality metaphases were obtained, showing chromosomes of
good length, well-extended, and with sharp banding, which made it possible to observe
and analyze the karyotype of the volunteers, identifying and grouping the chromosomes
according to their shape, size, centromere position, and banding pattern. In conclusion,
the technique allows the private laboratory to offer karyotype analysis to the population
of Itapúa and surrounding areas who have a history of genetic diseases and couples with
fertility problems, providing crucial information for genetic counseling and aiding in
decision-making regarding treatment options.
Keywords: Patient safety - Pharmaceutical validation - Health indicators - Patient
identification.
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1. Introducción
Los defectos cromosómicos se deben a un exceso o ausencia de genes contenidos en
cromosomas enteros o en fragmentos cromosómicos. Constituyen, en gran proporción,
motivo de pérdidas reproductivas, malformaciones congénitas y retraso mental, y tienen
un importante papel en la patogenia del cáncer (1). A veces, en los estudios citogenéticos
pueden detectarse algunas variaciones en la morfología de los cromosomas que no tienen
consecuencias en el fenotipo del paciente. Algunos de los heteromorfismos que suelen
aparecer con más frecuencia, se hallan en las regiones de heterocromatina de algunos
cromosomas (2). De forma rutinaria, el diagnóstico de los defectos cromosómicos se
realiza mediante el estudio del cariotipo, que consiste en el análisis del número y
estructura de los cromosomas al microscopio óptico (1).
El cariotipo se trata del análisis cromosómico de un individuo. Un total de 46 cromosomas
pueden ser observados mediante la utilización de un microscopio, 22 pares de
cromosomas somáticos y un par de cromosomas sexuales, X e Y (3). 46 XX y 46 XY
constituyen la forma de representar el cariotipo de una mujer y un varón, respectivamente
(4). El cariotipo es una herramienta importante para el médico genetista, ya que permite
el diagnóstico de síndromes asociados a alteraciones cromosómicas numéricas o
estructurales y, de esta manera, proporcionar un manejo clínico y asesoramiento genético
adecuado a los pacientes (5). Actualmente, gran parte de las anomalías fenotípicas
causadas por alteraciones cromosómicas, tales como, malformaciones congénitas, bajo
peso y síndromes hereditarios, tienen como la característica clínica más común, la
deficiencia mental y pueden ser diagnosticadas en el periodo prenatal (6).
El estudio de cariotipos a partir de cultivos de linfocitos es crucial en genética clínica e
investigación, y se utiliza en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades genéticas (7),
como el síndrome de Down (trisomía 21), el síndrome de Edwards (trisomía 18) y el
síndrome de Patau (trisomía 13) (8) (9), conocidas como alteraciones numéricas, y otras
alteraciones cromosómicas denominadas estructurales, como deleciones, duplicaciones e
inversiones; y tiene una influencia importante en la necesidad de estudiar o no a los padres
para estimar la probabilidad de recurrencia en la familia.
5
Según el Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social (MSPyBS), la prevalencia
estimada de este tipo de enfermedades es de 1 por cada 500 nacimientos (10). En
Paraguay, el Registro Nacional de Defectos Congénitos informaron en el 2019, 2 recién
nacidos con Síndrome de Patau, 14 recién nacidos con Síndrome de Edwards y 76 recién
nacidos con Síndrome de Down (11).
También, puede revelar alteraciones en los cromosomas sexuales, como la presencia de
un cromosoma adicional en hombres (síndrome de Klinefelter) o la ausencia de un
cromosoma X en mujeres (síndrome de Turner) (9). Estas anomalías pueden ocasionar
problemas de fertilidad, por lo tanto, pueden guiar el manejo y tratamiento adecuados. Es
por eso que, desempeña un papel importante en la evaluación de la infertilidad, tanto en
hombres como en mujeres para investigar posibles causas genéticas subyacentes. Aunque,
en la actualidad, se cuentan con herramientas diagnósticas moleculares, el cariotipo en
sangre periférica sigue siendo la primera línea de estudio para la detección de problemas
cromosómicos en personas con trastornos reproductivos (5), ya que, puede identificar
anomalías cromosómicas estructurales o numéricas que podrían estar relacionadas con
problemas de fertilidad (12). Por ejemplo, las translocaciones cromosómicas equilibradas,
en las que hay un intercambio de material genético entre cromosomas, pueden aumentar
el riesgo de abortos espontáneos recurrentes o de tener hijos con trastornos genéticos (13).
En hombres, el cariotipo puede revelar anomalías como microdeleciones del cromosoma
Y o anormalidades en los cromosomas sexuales (por ejemplo, síndrome de Klinefelter o
síndrome de Y frágil). En mujeres, el cariotipo puede detectar anomalías cromosómicas
que afectan la estructura o el número de cromosomas, como el síndrome de Turner
(monosomía X) o las anomalías estructurales de cromosomas sexuales (14). Estas
alteraciones cromosómicas pueden estar asociadas con problemas en la ovulación, la
calidad de los óvulos, afectar la producción y función de los espermatozoides, y la
implantación del embrión. Es por ello que, permite establecer un vínculo entre las
alteraciones genéticas, el tratamiento y el pronóstico de la infertilidad de las parejas que
optan cada vez más por terapias alternativas de concepción asistida y otras técnicas
reproductivas (15).
6
La citogenética, también, se utiliza para la investigación de varias enfermedades
oncológicas. En contraste al carcinoma epitelial, las anomalías genéticas en las
enfermedades oncohematológicas, por lo general, están involucradas las translocaciones
cromosómicas recíprocas o balanceadas. Por lo tanto, las técnicas utilizadas en la
detección de alteraciones cromosómicas son más relevantes en oncohematología que en
otras esferas de la oncología. Continúa siendo el estudio estándar de oro de la genética y
el más pedido en el campo, comúnmente, para el diagnóstico y seguimiento de varias
leucemias, ya que fue la primera prueba genética utilizada en la práctica clínica para el
diagnóstico (16).
El cariotipo es preparado a partir de células vivas, generalmente de linfocitos de sangre
periférica o médula ósea. Generalmente, el cultivo de linfocitos a partir de sangre
periférica se utiliza para diagnósticos de enfermedades genéticas no invasivas. Sin
embargo, las células malignas de médula o ósea o sangre periférica son utilizadas para la
identificación de alteraciones citogenéticas en enfermedades hematológicas, aunque el
rendimiento de estas células puede ser subóptimo (16).
Para la obtención del cariotipo humano es necesario realizar cultivo celular a partir de
muestras de sangre periférica, médula ósea o líquido amniótico, siendo el método más
común el cultivo de linfocitos a partir de sangre periférica. Las células se cultivan en un
medio favorable que utilizan mitógenos (estimulante de la división celular) de linfocitos
T, como la phytohemagutinina (PHA), para mejorar la división mitótica y obtener
abundantes metafases. Se obtiene cromosomas en metafase, estos, son analizados por
medio del bandeo G que consiste en el tratamiento de los cromosomas con proteasas, y
su coloración con colorante Giensa. Los patrones de bandas son originados de la
interacción del ADN y las proteínas presentes en el colorante (tiazina y eosina) (17).
En el país, a nivel público, se cuenta con el Laboratorio de Citogenética del Instituto de
Investigación de Ciencias de la Salud de la Universidad Nacional y el Programa Nacional
de Defectos Congénitos, del Ministerio de Salud, ubicados en la ciudad de San Lorenzo
del Departamento Central, el cual, ofrece estudios de citogenética convencional y
citomolecular (18) (19). Sin embargo, en el interior del país, específicamente, en el
departamento de Itapúa no se cuenta con laboratorios que hayan implementado la técnica,
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es decir, no existen registros de comunicaciones o publicaciones al respecto dentro de la
base de datos del Centro de Información Científica del CONACYT (CICCO) (20).
Es por eso, que el objetivo de esta investigación fue estandarizar la técnica de cultivos de
linfocitos a partir de sangre periférica, para el análisis citogenético de cariotipos humanos
en un laboratorio privado de la Ciudad de Encarnación, de forma que, pueda ser utilizado
para ofrecer un diagnóstico citogenético a la población del Departamento de Itapúa.
2. Metodología
Se realizó un estudio de tipo experimental, de corte transversal y con finalidad aplicada,
en el área de Biología Molecular y Citogenética del Laboratorio privado RH Positivo, en
Encarnación, Itapúa. El material biológico fue recolectado de 10 personas de forma
voluntaria. Se realizaron extracciones de 3 – 5 ml de sangre periférica en jeringas
heparinizadas tomando todas las medidas de esterilización y bioseguridad.
Cada voluntario firmó un consentimiento informado, donde se explica la participación
del estudio, así como, se establece el tratamiento confidencial de los resultados y de sus
datos personales. Además de responder a una serie de preguntas que facilitarían la
interpretación de los resultados y el diagnóstico citogenético. Las cuales abarcaban,
antecedentes familiares, uso de medicamentos y transfusión de sangre o médula ósea.
Para el cultivo de linfocitos de sangre periférica se utilizó el medio para cariotipo PB-
MAX™, el cual, se trata de un medio RPMI 1640 optimizado y suplementado, que
contiene suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y fitohemaglutinina (PHA). Este, se basa
en formulaciones a las que se hace referencia en el Manual de laboratorio de la Asociación
de tecnólogos citogenéticos para el cultivo de linfocitos de sangre periférica para análisis
citogenéticos. Las muestras se sometieron por duplicado a dos ensayos; el primero,
siguiendo las instrucciones del fabricante y el segundo, con modificaciones (21).
Para el primer ensayo, se cultivaron 0,5ml de sangre periférica heparinizada en tubos
cónicos estériles con tapa a rosca, con 10ml de medio para cariotipo PB-MAX™. Se
cultivaron por 72hs en una incubadora, a 37°C.
Transcurrido ese tiempo, se agregaron 500ul de solución KaryoMAX™ Colcemid™
(colchicina) en los tubos de cultivo y se incubaron durante 15 minutos a 37°C. Se
centrifugaron los tubos a 1500 rpm por 10 minutos. Se descartó el sobrenadante de cada
8
tubo y se agregaron 8ml de solución hipotónica (0,075 M KCl) a pH 7 y temperatura
ambiente. El material se homogeneizó con una pipeta Pasteur estéril y se incubó a 37°C
por 30 minutos.
Para realizar la fijación del material, se añadió 1ml de solución Carnoy (metanol, ácido
acético 3:1) y se dejó reposar a una temperatura de -20°C por 1 hora. Posteriormente, se
homogeneizó y centrifugó a 1500 rpm por 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y se
agregaron 4ml de solución Carnoy frío (-20°C) para lavar el material. Nuevamente, se
homogeneizó y centrifugó a 1500 rpm por 10 minutos. Se descartó el sobrenadante
dejando 1ml en el tubo. Estos lavados se repitieron 3 veces más y al final, se descartó el
sobrenadante dejando 1ml aproximadamente en el tubo, el cual, se utilizó para realizar
los extendidos.
Para el segundo ensayo, se cultivaron 0,5ml de sangre periférica heparinizada en tubos
cónicos estériles con tapa a rosca, con 8ml de medio para cariotipo PB-MAX™. Se
cultivaron por 72hs en una incubadora, a 37°C.
Transcurrido ese tiempo, se agregaron 250ul de solución KaryoMAX™ Colcemid™
(colchicina) en los tubos de cultivo y se incubaron durante 20 minutos a 37°C. Se
centrifugaron los tubos a 1500 rpm por 10 minutos. Se descartó el sobrenadante de cada
tubo y se agregaron 8ml de solución hipotónica (0,075 M KCl) a pH 7 y temperatura
ambiente. El material se homogeneizó con una pipeta Pasteur estéril y se incubó a 37°C
por 40 minutos.
La etapa de fijación del material, se realizó siguiendo los mismos pasos anteriormente
mencionados.
Para los extendidos, se utilizaron portaobjetos limpios y desengrasados. En cada
portaobjetos se colocaron de 3 a 4 gotas del material a una altura de aproximadamente 30
cm. Los portaobjetos se secaron por flameado en mechero, luego, se sometieron a calor
(100°C) por una hora y se protegieron de la luz durante 10 días antes de realizar en
bandeo.
Para el bandeo de los extendidos, se siguió la técnica de Seabright (1971) con
modificaciones. Los extendidos se sometieron a un tratamiento enzimático con solución
de tripsina al 0,05%, a pH 7 y 37°C en baño termostático durante 30 segundos a 1 minuto.
9
A continuación, se enjuagaron en solución fisiológica para neutralizar la acción
proteolítica de la tripsina y se colorearon con Giemsa al 10% entre 5 a 10 minutos.
La observación se realizó bajo un microscopio óptico, a 1000X con aceite de inmersión.
Las metafases se fotografiaron y las imágenes se recortaron y transformaron en escala de
grises. El ensamblaje del cariotipo se realizó con Adobe Photoshop.
3. Análisis de los resultados
En el primer ensayo se obtuvieron pocas células en metafase, las cuales, se observaban
muy cerradas al microscopio óptico con presencia de un halo de citoplasma que impedía
la fácil identificación de los cromosomas. En cuanto a los cromosomas que se podían
distinguir, éstos estaban muy cortos, lo que impedía la identificación de las bandas. Sin
embargo, en el segundo ensayo se obtuvieron muchas células en metafase, bien abiertas,
sin halo de citoplasma, lo que facilitaba la distinción una de otras. Se observaron
cromosomas de longitud variada y de fácil identificación de bandas.
Con respecto a la cantidad de células en metafases obtenidas, se pudo notar que el
volumen de medio para cariotipo PB-MAX™ (RPMI 1640, FBS, L-glutamina y PHA)
no interfería con la cantidad de linfocitos obtenidos en el cultivo, ya que, en el segundo
ensayo se utilizó menos volumen. La PHA juega un papel fundamental en la obtención
de un cultivo con mayor número de células, ya que es un agente mitógeno, es decir,
aumenta la actividad mitótica en las células expuestas. Además, la PHA también provoca
la aglutinación de los glóbulos rojos, lo que facilita su eliminación en las etapas
posteriores al cultivo (17).
Sin embargo, se pudo notar que la cantidad de solución KaryoMAX™ Colcemid™
(colchicina) interfería tanto en el crecimiento celular, como en el acortamiento de los
cromosomas en el primer ensayo. Ya que, se pudieron observar diferencias entre un
ensayo y otro, obteniéndose mejores resultados en el segundo ensayo. La colchicina es
una sustancia antimitótica que bloquea la división celular durante la metafase, es decir,
inhibe la mitosis de las células en división y funciona como un microtubulos o veneno
del huso. En caso de sobredosis, afecta preferentemente a las células que se dividen
rápidamente. En altas concentraciones es un veneno celular general (22). En otros ensayos
se evidenció un proceso eficaz de proliferación y detención del ciclo celular en etapa de
10
metafase, reflejando un buen desempeño de la colchicina en la cantidad (200 µl) a la que
fueron expuestos los cultivos a las 72 horas de incubación y con mayor tiempo de
exposición (23).
En cuanto al halo de citoplasma presente alrededor de los cromosomas en metafase en el
primer ensayo, se debió al menor tiempo de exposición del cultivo a la solución
hipotónica (KCl 0,075) y al tipo de pipeteo para su homogeneización, ya que, se pudieron
observar en el segundo ensayo, células sin halo de citoplasma con cromosomas más
separados y mejor coloreados. Las células son sometidas a un proceso de shock
hipotónico en presencia de una solución KCl 0.075M, generando el movimiento de
moléculas al interior de las mismas logrando un aumento en su volumen y facilitando la
lisis de las membranas en el proceso de fijación y extendido de los preparados,
permitiendo la observación de las metafases (24). En un estudio, se sometieron a las
muestras a 3 tiempos diferentes y se observaron que los extendidos con mejor distribución
de los cromosomas en el campo microscopio fue conforme se aumentó el tiempo de
exposición a la solución hipotónica, debido a la baja cantidad de cruces entre cromosomas
y la ausencia de membrana celular, de igual manera se observó para este caso mayor
eficacia de lisis celular, con respecto a los demás tiempos de exposición (23).
En cuanto al bandeo y la coloración, se siguió el protocolo descripto, sin embargó se
evidenciaron variaciones en el patrón de bandas de los cromosomas. Los extendidos se
sometieron a diferentes tiempos, mostrando mejores resultados cuanto a resolución y
calidad de bandas los de mayor tiempo de tripsinización, los cuales se pudieron identificar
y analizar de forma clara.
De forma general, en la estandarización del cultivo (segundo ensayo), se obtuvieron
metafases de calidad satisfactoria que presentaron cromosomas de buena longitud, bien
extendidos y con bandeo nítido. Lo que hizo posible observar y analizar el cariotipo de
los voluntarios, identificando y agrupando a los cromosomas de acuerdo a su forma,
tamaño, posición del centrómero y patrón de bandas.
4. Conclusiones
La implementación y estandarización de la técnica para el cultivo de linfocitos a partir de
sangre periférica es de gran importancia, antes de realizar cualquier otro tipo de prueba
11
de análisis cromosómico, ya que, su obtención puede verse alterada por diferentes
factores, siendo necesario realizar ajustes puntuales al procedimiento para garantizar
resultados confiables y de calidad. Esto, permite ofrecer una técnica segura para la
obtención de las células en metafase y en conjunto con los diversos factores que influyen
en la puesta a punto de la técnica, permiten un resultado optimizado, con un mayor
número de células y, por lo tanto, mayor frecuencia de células en metafase para la
diferenciación de los cromosomas y su clasificación de forma fácil, observándose el
tamaño, posición de los centrómeros y el patrón de bandas.
Resumiendo, se puede decir que la técnica permite ofrecer la realización del análisis de
cariotipo a la población de Itapúa y alrededores que presenten antecedentes de
enfermedades genéticas y parejas con problemas de fertilidad, proporcionando
información crucial para el asesoramiento genético y ayudando en la toma decisiones
sobre las opciones de tratamiento.
Es importante destacar que el cariotipo no es la única prueba utilizada en la evaluación
de anomalías genéticas, ya que, existen otros estudios genéticos y pruebas adicionales
que se realizan en conjunto para obtener un diagnóstico más completo. Sin embargo, sigue
siendo la técnica Gold estándar por su bajo costo.
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